雜交膜上有很多非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合位點，為防止這些位點與抗體結(jié)合引起非特異的染色和背景，一般用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉膜上的未結(jié)合位點來降低抗體的非特異性結(jié)合。封閉劑應該封閉所有未結(jié)合位點而不替換膜上的靶蛋白、不結(jié)合靶蛋白的表位，也不與抗體或檢測試劑有交叉反應。zui常見的封閉劑是BSA、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠和Tween-20(0.05 - 0.1%)稀溶液PBST 或者TBST。

p 5%脫脂奶粉或BSA(室溫孵育1 h)

p western Blot 膜封閉液(生物試劑公司)

p Tween-20的作用：Tween-20是一種非離子型去污劑，有復性抗原的作用，可提高特異性的識別能力。在做westen blot時，用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉膜上的未結(jié)合位點可以降低抗體的非特異性結(jié)合。Tween 這種非離子型去污劑在乳化蛋白時，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，可減少對蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞。離子型去污劑如SDS則破壞蛋白的結(jié)構(gòu)。

封閉劑選擇的特殊情況：

p 脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標記的抗體一起使用，因為脫脂奶粉含有糖蛋白和生物素。

p 如果封閉劑中含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因為磷酸酶與印記膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化。

p 檢測磷酸化抗體時，不能使用酪蛋白/脫脂奶粉作為封閉劑。

一般封閉條件為：

室溫或者 37℃緩慢搖蕩1～2 h，特殊情況也可 4℃過夜。根據(jù)結(jié)果情況調(diào)整封閉試劑的濃度和類型。比如有時 BSA 比脫脂奶粉更有利于降低非特異性背景，而有些抗體則在脫脂奶粉封閉的情況下才能得到清晰的背景。

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