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膠原蛋白酶2,9檢測試劑盒

試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測MMP-2、MMP-9活性。Zymography是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達(dá)1 nM，高于ELISA方法²，其基本原理和程序是：制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer孵育，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能同時(shí)指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶譜)及活性。

操作步驟：

1.    制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS-PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，90 ºC加熱5分鐘，分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

2.     待測樣品1:1稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染Marker即可。陽性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100µl全血與100µl 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer等體積混合，取5-15µl上樣。

3.    低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。

4.     洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 18小時(shí)，中間換液。

5.     孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37ºC孵育1~5小時(shí)。陽性對照或者血中的MMP通常37ºC孵育1小時(shí)即可顯示。如MMP活性低，應(yīng)延長孵育時(shí)間為10小時(shí)或過夜。

6.     顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。

膠原蛋白酶2,9檢測試劑盒